台灣豬瘟病毒特性、病理變化及檢驗標準

程嘉華(Jessie)

台灣豬瘟病毒特性、病理變化及檢驗標準--- 作者： 鍾明華　李淑慧　黃天祥　林有良

http://vettech.nvri.gov.tw/Articles/institute/425.html

一、病毒之特性

(一) 豬瘟 (Hog cholera) 是由濾過性病毒所引起的一種高度傳染性敗血症，以全身性出血為主徵，感染率與死亡率均高達九五％至一○○％。本病一般呈急性病程，但可轉為慢性。在甚急性病例僅見極輕微的病變或不見病變，而在急性和亞急性病例則可見相當嚴重的病變。
　　本病最早於西元一八一○年發生於美國田納西州，唯首次確診豬瘟病例則屬一八三三年發生於美國愛渥華州，當時造成養豬業極大的損失。嗣後，一八六二年傳至歐洲，然後散佈至世界其他各地。
　　本病在臺灣從日據時代即發生且頗猖獗。一九四七年豬瘟發生率曾高達八．一三％，使養豬業者遭受極大損失。最初，在一九二九年至一九四八年間本省曾使用寺門氏福馬林臟器疫苗防疫豬瘟，此種疫苗之安全性雖高，但免疫效力不理想。一九四九年順利製成結晶紫豬瘟疫苗後，即試行結晶紫豬瘟疫苗之全面性預防注射計畫，惟結晶紫豬瘟疫苗因其免疫效力短暫及豬隻移動的頻繁，使豬瘟防疫效果不如預期理想。自一九五八年全面使用兔化豬瘟活毒疫苗 (LPC) 預防控制後，在一九六五年時豬瘟發生率遂降為○．○二％，但至今仍無法完全防止豬瘟的零星發生。  
(二) 豬瘟病毒是屬於黃病毒科 (Flaviridal)、瘟疫病毒屬 (Pestivirus) 的 RNA 病毒，與牛病毒性下痢 (Bovine Viral Diarrhea) 病毒同屬 Pestivirus。
　　野外病毒的病毒毒力差異頗大，強毒株可引發急性病例而導致高死亡率，中等毒株引起亞急性與慢性感染，至於弱毒株感染則可能呈不顯性感染，然而弱毒株可能會引起胎兒與新生仔豬的死亡。豬瘟病毒對環境的抵抗力屬於中等度。在豬舍，豬體、排泄物等，依溫度變化平均可以存活數天之久，冷凍豬肉或冷藏豬肉，屠體可以保存數月或甚至一年以上，這也就顯現其流行病學的重要性，病毒可以被 2％ 氫氧化鈉 (Sodium hydroxide) 或脂溶性化學物破壞。 　　  
(三) 豬瘟病毒屬於 RNA 病毒，在血清學分類上，包括兔化豬瘟疫苗毒只有一種血清型。但有學者依血清中和試驗的結果將豬瘟病毒分類為兩種亞群，第一種亞群是包含了豬瘟強毒株和已馴化的疫苗毒株，而第二種亞群是一些豬瘟弱毒株和中間毒株。另有學者以野外分離的豬瘟病毒株進行中和能力的比較分析，發現野外存有不同抗原性及病原性的病毒株，因此認為豬瘟病毒並非屬於單一型。
　　由於豬瘟病毒只存在一種血清型，故採用免疫血清學的方法，如免疫擴散法，螢光標示抗體染色法等，皆無法區別豬瘟野外毒與兔化豬瘟疫苗毒。
　　但國外有學者發表利用多株的單源抗體進行競爭結合法及抗原捕捉法可區別豬瘟野外毒及兔化豬瘟疫苗毒。
　　從病毒核酸的觀點上要區別豬瘟野外毒及兔化豬瘟疫苗毒，可就容易多了。由於目前有多株的豬瘟野外毒與兔化豬瘟疫苗毒已被部分定序出來了，可針對病毒核酸的差異上來設計引子，目前本所已成功地設計出針對兔化豬瘟疫苗毒特異性之引子，只要將檢測樣品進行 RT-PCR 反應，若樣品中存在有兔化豬瘟疫苗毒必定會出現特異性 RT-PCR 產物，野外毒則無產物出現。另外亦可應用 RT-PCR 方法配合限制片段多形性分析 (RFLP) 來區別豬瘟野外毒及兔化豬瘟疫苗毒，方法是從豬瘟病毒核酸中會轉譯出病毒醣蛋白而引發宿主產生中和抗體的一段特定基因中，先設計出一對具有較長 RT-PCR 產物的廣泛性引子 ( 約 2,300 bp)，再將此對引子增幅豬瘟野外毒及兔化豬瘟疫苗毒，由於是屬於廣泛性引子，故皆可產生長片段的 RTP-CR 產物。再將增幅後的 RT-PCR 產物，選用限制進行 DNA 切割，再利用電流使其泳動分離。不同大小的 DNA 片段會因分子量不同而分開，即出現所謂的切割型態，結果兔化豬瘟疫苗毒出現的切割型態與野外毒不同，其至野外毒中亦出現若干種不同的切割型態，表示野外毒中亦可區分成若干種不同的病毒株。目前應用此方法可將 65 個田間分離到的豬瘟病毒區分成 7 種不同的切型態，而兔化豬瘟疫苗毒的切割型態又不同於此 7 種切割型態，這表示台灣田間的豬瘟病毒至少存在有 7 種不同的病毒株。
　　目前應用分子生物學的方法已經很容易將豬瘟野外毒與兔化豬瘟疫苗毒做區別，即從診斷的觀點上來區分此兩種病毒已無困難了。  

二、流行病學

　　豬瘟病毒的自然宿主為豬和野豬，而在其他動物如兔子和天竺鼠亦能馴化增殖，病毒經馴化後毒力減弱可當疫苗種毒使用。豬瘟感染豬及其分泌排泄物為豬瘟主要傳染源。病毒可經由患畜之尿液、糞便、淚腺以及鼻腔分泌物而排出體外，因此接觸傳染為豬瘟傳播之主要途徑。豬瘟雖能感染其他動物，但豬是唯一能產生症狀者。因此，豬是唯一的自然宿主也是最重要的感染源。
　　病毒亦能藉生物和無生物媒介傳染，例如污染衣物、鞋類、狗、貓、鳥、節肢動物、虻蠅、蚊蟲、旋毛幼蟲、載運車輛、板箱以及各項器具而機械性地傳染。
　　引進外表看似健康之豬隻入豬群中，常是爆發豬瘟最重要的原因。



三、致病機轉

　　豬瘟病發進入體內一般而言，首先在扁桃腺腺窩的上皮細胞增殖，然後藉由淋巴管散佈到鄰近淋巴結。一般而言病毒血症在感染後 24 小時內發生。藉血液進入其它淋巴組織如：脾臟、淋巴結、培耶氏斑、胸腺、骨髓、內皮細胞及循流中白血球，病毒在這些組織大量繁殖後，再侵入其它實質器官，如呼吸道及中樞神經。在感染後 3～4 天即到達許多上皮型細胞而開始排毒。病毒侵犯骨髓導致於白血球數下降與血小板數下降。血小板數下降伴隨血管內皮細胞傷害，在許多臟器產生點狀與斑狀出血。慢性豬瘟可能會併發腎絲球體性腎炎。豬瘟真正死因未明，但可能與擾亂循環如瀰漫性血管內凝血有關。懷孕母豬可以經胎盤感染，而有由髓鞘發育不全形成先天性振顫、死產、木乃伊化胎兒、滯產、畸型等症狀。

四、臨床症狀

　　豬瘟發生初期，豬群內往往只有少數豬隻呈現症狀。感染豬最初呈精神不振、食慾降低、行動遲鈍、體溫顯著升高 ( 通常在 41℃ 左右 ) 等現象，血中白血球量亦隨著體溫上升而減少。病程早期，豬眼部因結膜炎而有大量分泌物，嗣後分泌物變膿樣致使眼瞼完全膠著。體溫上升初期，病豬發生便祕，隨後發生嚴重水瀉性下痢，糞便顏色灰黃。病豬有顫抖現象，喜愛相聚一堆取暖，偶而嘔吐含有大量膽汁的黃色液體。少數病豬會發生抽搐，且在抽搐產生數小時內或多半在數天內即告死亡。病程後期後肢因衰弱無力，行走時步態不穩，並作搖擺狀頗為特殊，繼而發生後軀麻痺，病豬腹部、鼻端、耳尖以及四肢內側皮膚常可見紫色斑。
　　豬隻感染豬瘟以後，存活時間若超過 30 天以上，即將之歸類為慢性型。慢性型的特徵為長時間的病程以及間斷性的食慾不振、發燒、毒血症以及下痢。有時可見繼發於皮膚炎之後的脫毛現象，亦可見眼結膜炎，並排出大量眼分泌物與運動障礙，最後則變為後軀麻痺。另外慢性豬瘟病例經常發生白血球減少現象。
　　當弱毒株豬瘟病毒感染母豬時藉由胎盤感染可引發仔豬的遲發型豬瘟，其定義為當仔豬生下時一切正常，經過數週或數月後，慢慢的才有輕微的豬瘟症狀出現，如：輕微的厭食、精神不振、結膜炎、皮膚炎、間斷性的下痢及運動失調等，病症後期並有白血球增多的趨勢。

五、病理變化


　　在密集養豬國家，經採用各項防疫措施控制豬瘟後，豬瘟臨床和病理特徵隨之變化。除一般急性型豬瘟外，尚有慢性和非典型豬瘟的發生，輕微或不顯性豬瘟更為常見，致使豬瘟診斷發生困難而增加撲滅豬瘟的困擾。
　　典型豬瘟，無論豬齡大小易感豬一旦受豬瘟強毒感染後即呈典型急性或亞急性熱性傳染病。由口腔感染後，經二至四天潛伏期即發生熱反應 ( 攝氏四○至四一度 )，熱反應可持繼四至六天，稱為稽留熱。隨即發生淋巴球減少症，白血球之減少，中性球呈核左轉等現象。厭食、皮膚充出血、結膜炎、鼻腔分泌物增加，或下血痢便，甚至後軀痲痺和抽搐。患豬通常二週內斃死，死亡率可高達九○以上。典型豬瘟肉眼病變主為全身性脈管炎和淋巴球的破壞，包括廣泛性漿膜和粘膜下層的出血、血栓、脾梗塞和腸潰瘍以及淋巴結的周邊性出血。組織病變，除甚急性斃死豬外一般可見腦炎病變。腦炎是豬瘟特徵之一，以淋巴球為主的圍管現象，內皮細胞腫脹或增生和小神經膠質細胞過多為主徵。約有七五至九○％豬瘟病例會有圍管性非化膿性腦炎發生。
　　慢性豬瘟，特徵為早期呈急性感染，嗣後一段期間呈不完全性恢復，最後再度復發死亡。慢性豬瘟與持續性病毒血症以及免疫機能受損有關，在腎臟和其他臟器可見免疫複合物的沈積，結腸和盲腸常見纖維素性病變，肺臟呈出血性纖維素性肺炎，淋巴結可見淋巴球和發生濾泡 (germinal follicle) 的衰竭現象，以及玻璃樣絲球性腎臟之免疫病理過程。
　　非典型豬瘟或輕微型豬瘟，主要發生於豬瘟傳染病發生地區。臨床上主要感染幼齡豬隻，有熱反應、厭食、發育受阻等症狀，偶而亦有後軀痲痺和抽搐的神經症狀。部份非典型豬瘟症狀不明顯，病理上亦僅限於腎臟表面，膀胱和直腸粘膜的輕微出血病變，但若健康易感豬與此症狀不明顯之感染豬接觸則會突然轉為急性豬瘟病例。
　　易感懷孕母豬，在感染毒力較低之豬瘟病毒後，此種帶毒母豬雖無臨床症狀顯現，但可造成子宮內胎兒的感染。Young 最先發現馴化豬瘟活毒疫苗對胎兒的影響，懷孕三○天內母豬接種未完全馴化活毒疫苗結果初生仔豬可見胸水、腹水和局部性或全身性水腫現象。此種胎盤感染，在自然感染低毒力的懷孕母豬也同樣結果。子宮內胎兒感染會引起流產、死產、木乃伊化和出生時的死亡或小豬出生時縱未死亡亦常呈衰弱和先天性震顫、外八字腳及活力減低等症狀。
　　胎兒在子宮內感染較低毒力豬瘟病毒的結果與母豬懷孕階段有關。母豬在懷孕期間感染豬瘟病毒其分娩仔豬往往有免疫耐受性，無抗體產生而呈持續性帶毒狀態，這些豬雖從母豬攝取初乳移行抗體，但因持續性病毒作用結果而使移行抗體無法測出。此種小豬約先天性病毒血症可持續終生。Frey 等證實在懷孕七○天內受豬瘟病毒感染的胎兒，會產生免疫耐受性和持續性病毒血症。但胎兒於兔疫機能發生後，經子宮感染結果亦有免疫耐受性和持續性病毒血症現象。毒力較低之豬瘟病毒引起胎兒病變除與母豬之懷孕階段有關外，亦與母豬個體及胎次有關。
　　豬瘟病毒對網狀內皮系統細胞具有特異親嗜性。由於敗血的緣故，在急性或亞急性病例中，血管內皮細胞呈水樣變化和壞死，血凝機制亦受到破壞，結果產生身體組織及臟器的廣泛性水腫和出血，最常發生於淋巴結及腎臟，淋巴結週邊性出血為豬瘟頗為特殊的病變，腎臟於腎包膜下表面產生稀疏點狀出血。其它出血病變臟器包括心臟、肺臟、膀胱、腸粘膜、喉頭、會厭、肌肉、皮膚以及一般的漿膜和粘膜。此外，感染豬約有 25～65％ 有脾梗塞，一般認為脾梗塞是豬瘟具有診斷價值的特殊病變，於脾臟周圍表面形成大小不等的黑色隆起斑塊狀病變。
　　在甚急性病例，可能沒有肉眼病變。慢性病例，在盲腸與結腸常出現鈕扣狀潰瘍。至於胎兒病變包括腹水、肝結節狀、肺發育不全、皮膚點狀出血、小腦畸型、水腦及小腦發育不全等。
　　組織病理變化，泛腦炎 (Panencephalitis) 尤其存在延腦、橋腦、中腦 ( 這三部分合稱腦幹 ) 及丘腦等處。病變包括淋巴球圍管理象、內皮細胞增生、微神經膠質細胞增生及局部壞死等。

六、診斷

(一) 典型急性豬瘟可以由病史、臨床症狀、體溫及肉眼病變而獲得初步診斷，當然解剖更多病豬可以提高診斷的正確性。白血球數下降在許多病例中可以出現。本病需與非洲豬瘟、敗血症型沙門氏症、巴士德菌症、鏈球菌症、豬丹毒及豬嗜血桿菌感染等做鑑別診斷。所有懷疑病豬的確診應藉助實驗室的方法。實驗室的診斷最常用的方法是利用冷凍切片做免疫螢光染色證實存在豬瘟抗原。易檢出的病材包括扁桃腺 ( 最常見 )，會厭淋巴結、脾臟、腎臟及末段迴腸。
(二) 豬瘟國家診斷標準
　　因豬獲得免疫狀況的不同及病毒毒力的差異，豬瘟臨床和病理上差異也極大。因此，正確診斷需賴各項診斷措施的配合。由田間疫情、臨床症狀、肉眼和組織病理學檢查結果只能懷疑為豬瘟，必須再進行豬瘟病毒檢測及血清豬瘟中和抗體測定才能確診。豬瘟病毒檢測適用於發病豬隻，而血清豬瘟中和抗體測定，只適用於未曾施打豬瘟疫苗之豬隻。
1.豬瘟病毒檢測
(1) 冷凍切片－螢光標示抗體染色法
(a) 將採得臟器組織塊切成約長一公分、寬○．五公分、厚約○．三公分之組織塊以色埋液包埋病材，先以低溫快速冷凍後，並以水黏附於標本座上。
(b) 將組織塊置於攝氏零下二○度冷凍三○分鐘後以冷凍切片機，切成厚約四至八微米 (μ) 之薄片，並以玻片取下組織薄片。
(c) 玻片標本以吹風機急速於室溫吹乾，並以保存在攝氏零下二○度丙酮於冷藏狀態下固定十分鐘後，浸泡於 0.0l M PBS 中，上下振動玻片以除去固定液。
(d) 在組織片上滴上經適當稀釋之豬瘟螢光標示抗體○．一毫升 (ml)，置於攝氏三十七度感作三○分鐘後以 0.0l M PBS 清洗三次，去除未作用螢光標示抗體。
(e) 滴上一滴甘油磷酸緩衝液 (0.0l M PBS：甘油 ＝1：1)，以蓋玻片覆蓋標本並除去多餘液體後，於螢光顯微鏡下觀察有無豬瘟特異性螢光。
(f) 判定：陽性感染豬之豬瘟特異性螢光出現於感染細胞質內；而陰性豬隻則無特異性螢光產生，宜再實施病毒分離或聚合鏈反應檢測。

(2) 細胞培養─直接螢光標示抗體染色法
(a) PK-15 或其他豬隻來源株化細胞，於七十五平方公分面之細胞培養瓶長滿後，將細胞生長液倒出並於每支細胞培養瓶加入五至十毫升 (ml) 溫細胞消化液沖洗一次。如此，重複沖洗二次。第二次倒出細胞消化液時，留少許細胞消化液於瓶內。將細胞培養瓶放置攝氏三十七度消化三分鐘，或直至細胞脫落後，以原細胞培養瓶生長液三倍量之含 10％ 胎牛血清的細胞生長液沖散細胞 ( 通常一支培養瓶用三○毫升 )，作成細胞懸浮液。於二十四孔細胞培養盤，每孔加入一毫升細胞懸浮液，放置攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內培養二天。
(b) 以含 2％ 胎牛血清十倍抗生素之 MEM，做成 10％ 之脾臟、淋巴結、扁桃腺等檢體乳劑，經攝氏四度，1,000Xg 離心三○分鐘後取上清液。
(c) 將二十四孔細胞培養盤培養二天之 PK-l5 細胞或其他豬隻來源株化細胞，經滅菌 0.0l M PBS 洗過後，每孔分別接種入○．五毫升 (ml) 上述臟器乳劑上清液，每樣病材接種兩孔。另留四孔，兩孔各接入○．五毫升 (ml) 細胞維持液作為正常細胞對照；而其他兩孔則各接入○．五毫升 (ml) 已知豬瘟病毒液作為陽性標準對照。放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內感作四○分鐘，感作期間每隔十分鐘輕搖一次。
(d) 除接種細胞維持液者外，其餘各孔將接種液抽去並以滅菌 0.0l M PBS 清洗細胞面三次。再於每孔加入 1ml 含 2％ 胎牛血清之細胞維持液，然後放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內培養四十八小時。
(e) 抽去培養液並以 0.0l M PBS 清洗細胞面一次後，以吹風器吹乾。於每孔加入 1 ml 美製中性福馬林，在室溫中固定二○分鐘，再以 0.01 M PBS 清洗三次，以除去固定以液。
(f) 於每孔加入經適當稀釋之豬瘟螢光標示抗體 0.5 ml，攝氏三十七度感作三十分鐘後以 0.0l M PBS 清洗三次，去除未用螢光標示抗體。
(g) 於每孔加入 0.3 ml 甘油磷酸緩衝液後，於倒立螢光顯微鏡下觀察有無豬瘟特異性螢光。
(h) 判定：接種已知豬瘟病毒液之陽性標準對照其感染細胞之細胞質內會呈現豬瘟特異性螢光；而接入細胞維持液之正常細胞對照則無特異性螢光產生。接種病材乳劑上清液之細胞，若與陽性標準對照相同可見豬瘟特異性螢光，係屬豬瘟感染豬；若與正常細胞對照一樣無特異性螢光產生，則為豬瘟陰性。

(3) 細胞培養－間接螢光標示抗體染色法
(a) PK-15 或其他豬隻來源株化細胞，放七十五平方公分面之細胞培養瓶長滿後，將細胞生長液倒出，並於每支細胞培養瓶加入五至十毫升 (ml) 溫細胞消化液沖洗一次。如此，重複沖洗二次。第二次倒出細胞消化液時，留少許細胞消化液於瓶內。將細胞培養瓶放置攝氏三十七度消化三分鐘，或直至細胞脫落後以原細胞培養瓶生長液三倍量之含 10％ 胎牛血清的細胞生長液沖散細胞 ( 通常一支培養瓶用三○毫升 )，作成細胞懸浮液。於二十四孔細胞培養盤，每孔加入1 ml細胞懸浮液，施置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內培養二天。
(b) 以含 2％ 胎牛血清十倍抗生素之 MEM，做成 10％ 之脾臟、淋巴結、扁桃腺等檢體乳劑，經攝氏四度，1,000Xg 離心三○分鐘後取上清液。
(C) 將二十四孔細胞培養盤培養二天之 PK-15 細胞或其他豬隻來源株化細胞，經滅菌 0.0lM PBS 洗過後，每孔分別接種入 0.5 毫升 (ml) 上述臟器乳劑上清液，每樣病材接種兩孔。另外四孔，二孔各接入 0.5ml 細胞維持液作為正常細胞對照；而其他二孔則各接入 0.5 ml 已知豬瘟病毒液作為陽性標準對照。放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內感作四○分鐘，感作期間每隔十分鐘輕搖一次。
(d) 除接種細胞維持液者外，其餘各孔將接種液抽去並以滅菌 0.01M PBS 清洗細胞面三次。再於每孔加入 1ml 含 2％ 胎牛血清之細胞維持液，然後放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內培養四十八小時。
(e) 抽去培養液並以 0.01 M PBS 清洗細胞面一次後，以吹風器吹乾。於每孔加入 1ml 美製中性福馬林，在室溫中固定二○分鐘，再以 0.01 M PBS 清洗三次，以除去固定以液。
(f) 於每孔加入經適當稀釋之豬瘟螢光標示抗盤 0.5ml，攝氏三十七度，感作三十分鐘後以 0.01 M PBS 清洗三次，去除未用抗體。
(g) 於每孔加入經適當稀釋之山羊抗豬 IgG 螢光標示抗體○．五毫升，置於攝氏三十七度感作三○分鐘後以 0.01 M PBS 清洗三次，去除未用螢光標示抗體。
(h) 於每孔加入 0.3 ml 甘油磷酸緩衝液後，於倒立螢光顯微鏡下觀察有無豬瘟特異性螢光。
(i) 判定：接種已知豬瘟病毒液之陽性標準對照其感染細胞之細胞質內會呈現豬瘟特異性螢光；而接入細胞維持液之正常細胞對照則無特異性螢光產生。接種病材乳劑上清液之細胞，若與陽性標準對照相同可見豬瘟特異性螢光，係屬豬瘟感染豬；若與正常細胞對照一樣無特異性螢光產生，則為豬瘟陰性。

(4) 反轉錄聚合鏈反應 (RT-PCR) 檢測
(a) 豬瘟病毒核酸萃取：
以 TrizoI total RNA extraction reagent 萃取，取 l cc 之 reagent 加入含有 sample 的 microtube 中，vortex 30 秒，室溫靜置 5 分鐘，再加入 0.2 cc chloroform，震盪混合均勻，於室溫靜置 3 分鐘，以 4℃、l2000 rpm 離心 15 分鐘，把上清液轉置於新的 microtube 中，並加入等量的異丙醇(isopropanol)，充分混合後，於室溫靜置 3 分鐘，以 4℃、l2000 rpm 雄心 20 分鐘，倒去上清液，再加入 50 μl 純乙醇，以 4℃、12000 rpm 離心 5 分鐘，用 micropipete 吸除上清液後風乾，最後將 60μl 無 Rnase DDW 加入風乾的 RNA 中，溶解後冷藏備用。
(b) One Tube RT-PCR
(a) 反應配方
dNTP (l.25mM) 8μl
l0 X Buffer (DNA polymerase) 5μl
primers 各 0.5μl
rRNasin (Promega) 0.2μl
AMV Rtase (Promega) 0.2μl
DNA polymerase 0.5μl
template 5.6μl
DDW (Rnase free) 30μl
tatal 　　　　50μl　　( 上層覆蓋 2 滴礦物油 )
註：primers 包含 Universal 及 LPC 特異性引子。



(b) 反應條件
(1) AHV3,4
42℃ 40 分鐘→94℃ 35 秒→45℃ 70 秒→72℃ 70 秒→共 30 cycles→72℃ 7 分鐘→4℃  
(2) LPC 1，2
42℃ 40 分鐘→94℃ 35 秒→58℃ 70 秒→72℃ 70 秒→共 30 cycles→72℃ 7 分鐘→4℃  





2.豬瘟抗體檢測
(1) 中和抗體測定 END法
(a) 中和試驗係以九十六孔微量塑膠培養盤進行試驗，以 50μl 細胞生長液作為稀釋液並加等量血清進行二倍連續稀釋。
(b) 稀釋後之血清再加入等量的 A76 豬瘟病毒液 (100 TCID50)，培養盤在震盪器上充份震盪後放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內感作一小時。
(C) 感作後每孔再加入 10μl 之初代豬睪丸細胞液 (4×105 個細胞)，然後放置在攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內培養四天。
(d) 經吸去培養液後，每孔加入以細胞生長液適當稀釋的宮寺株新城雞病病毒液 (1 HA 單位 )100μl 攻擊。再放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳之濕性培養箱內培養。
(e) 試驗中同時設立豬瘟陽性和陰性血清、豬瘟病毒、豬瘟與新城雞病病毒、新城雞病病毒以及正常細胞等對照組。標準陽性及陰性血清與預測血清的處理方法同。
(f) 每天觀察細胞情形並以第三天為最終判讀。
(g) 判讀時，若檢驗量過多而不便使用顯微鏡觀察，則可用 0.5％ 結晶紫／甲醇溶液固定染色十分鐘，以自來水沖洗乾淨後觀察之。
(h) 判讀無細胞病變 (CPE) 即為抗體陽性反應，代表血清中有豬瘟抗體。若判讀有細胞病變 (CPE) 即為抗體陰性反應，代表血清中無豬瘟抗體。豬隻血清中含有豬瘟中和抗體代表該豬隻曾經感染豬瘟病毒或曾經接種過豬瘟疫苗。

(2) 中和試驗間接螢光抗體法
(a) 待測血清先以 56℃，30 分鐘非動化處理。
(b) 將血清滴入 96 孔細胞培養盤每行首孔中 (50 μl/ 孔 )，加入等量細胞培養液行 2 倍連續稀釋。
(c) 每孔加入 50 μl 含 200 TCID50 之豬瘟病毒，置於震盪器上充分震盪混合後，置於 37℃5％CO2 暖箱內作用 90 分鐘。
(d) 每孔再加入 50 μl 內含 3×l05 豬腎株化細胞 /ml，送回 37℃5％CO2 暖箱培養 72 小時。
(e) 取出培養盤，甩棄培養液，以 0.l5 M Nacl 溶液清洗三次，以毛巾拍乾，再置於 37℃ 暖房乾燥 45 分鐘。
(F) 加入中性福馬林固定 5 分鐘，100μl／孔。
(g) 甩棄福馬林，以毛巾拍乾以 0.l5 M Nacl 清洗三次，以毛巾拍乾。
(h) 加入適當稀釋濃度之豬隻抗豬瘟血清 ( 第一抗體 )，每孔 50μl( 稀釋液為 0.5 M Nacl＋l％ Tween 20，pH 7.6 送入 37℃5％CO2 暖箱，作用 60 分鐘。
(i) 甩棄第一抗體，以毛巾拍乾後，以 0.l5 M Nacl 清洗三次，再拍乾。
(j) 加入適當稀釋濃度之山羊抗豬 IgG 螢光標示抗血清 ( 第二抗體 ) 每孔 50μl，( 稀釋液同第一抗體 ) 送入 37℃5％CO2 暖箱，作用 60 分鐘。
(k) 甩棄第二抗體，以 0.l5 M Nacl 清洗一次。
(1) 抗體力價係採 50％ 螢光抑制計算之，亦即在可抑制一半細胞孔出現螢光 ( 病毒斑灶 ) 之血清最高稀釋倍數為抗體之力價。




七、預防及控制

　　豬瘟目前尚無有效的治療方式，防治的手段主要的依靠疫苗與清除計劃。下列幾點須加以注意：


1. 按政府規定約免疫適期，確實執行全面預防注射 ( 包括動物園野豬 )，除了可以收全國統一之效外，也可以使豬群的保護抗體在同一月齡時幾近相似。
2. 疫苗之購買、保存與使用須正確，並打耳標與做好記錄。
3. 引進豬隻必須確實與原來豬隻隔離飼養，並觀察至少 10 天以上，始可混養。此外注意是否由疫區輸入豬隻產品包括肉、精液、胚胎等。
4. 注意飼養衛生管理，定期實施消毒。
5. 加強疫情監視通報系統。
6. 提高國人守法精神。

附表：急性、慢性與遲發型豬瘟之比較：

( 摘譯自第七版豬病學 )  

***附表無法直接張貼，請進入網站詳閱。

蘇少儀

七、預防及控制
豬瘟目前尚無有效的治療方式，防治的手段主要的依靠疫苗與清除計劃。下列幾點須加以注意：
1. 按政府規定約免疫適期，確實執行全面預防注射 ( 包括動物園野豬 )，除了可以收全國統一之效外，也可以使豬群的保護抗體在同一月齡時幾近相似。
2. 疫苗之購買、保存與使用須正確，並打耳標與做好記錄。
3. 引進豬隻必須確實與原來豬隻隔離飼養，並觀察至少 10 天以上，始可混養。此外注意是否由疫區輸入豬隻產品包括肉、精液、胚胎等。
***個人觀察：批仔的移動及運輸車輛為臺灣豬場間豬瘟病毒散佈的主要途徑
4. 注意飼養衛生管理，定期實施消毒。
5. 加強疫情監視通報系統。
6. 提高國人守法精神。