精液稀釋：不同方法的比較

李仔

精液稀釋：不同方法的比較
作者：W.E. Morgan Morrow，北卡羅萊納大學
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在所有種公豬管理當中，良好的精液處理措施都是非常重要的一環。“預稀釋”則是最近逐漸受到重視的一項措施，就是在精液稀釋的過程中先加少量稀釋劑，然後再加入全部稀釋劑。
在最近加拿大多倫多舉行的美國豬獸醫年會上，Deborah Murray和明尼蘇達大學的三個同事Darwin Reicks博士、Chris Kuster博士和Bob Morrison博士對經過預稀釋的精液和未經預稀釋的精液進行了對比。以下是他們的研究報告。
介紹
種公豬精液預稀釋的目的主要是為了減輕精子的冷休克。影響精子功能的因素包括采精溫度、存儲溫度和懸浮媒介1。精液溫度如果突然從體溫降至15℃以下，就會出現冷休克，精子活力會降低2，可另一方面精液採集之後又必須儘快稀釋。另外，預稀釋情況下先加入少量（100ml）稀釋液，然後再加入全部稀釋液，讓滲透壓有一個逐漸變化的過程。預稀釋會讓新鮮精液迅速獲得抗生素的保護。一般公豬精液當中都含有細菌，濃度最高可達到1093cfu/ml。
然而，預稀釋需要花費更多的時間。與預稀釋相比，一次性全部稀釋可節省時間，而且只需操作一次，錯誤操作的風險較低。本研究的目的就是要搞清楚，在授精效果方面，預稀釋處理的精液與未經預稀釋的精液之間是否存在顯著的差異。
材料與方法
試驗精液采自69頭相同環境下飼養的不同日齡的雜交終端公豬。用徒手帶橡膠手套進行采精，精液采入3.8升的塑膠採集袋中，採集袋置於預熱過的杯子裏，袋內裝有紗布篩檢程式。對精液進行稱重，根據重量來估計一次射精的精子數。
對盛放精液的塑膠袋進行按摩（為了使樣品均勻一致），用吸管吸取一滴精液到預熱過的載玻片上，置於相襯顯微鏡下檢查精子的活力。根據精子活力將精液評定為合格或不合格。如果不合格，就將精液棄置。
用移液管吸取100微升精液，置於2.4ml檸檬酸鈉溶液中，混合均勻，然後用多通道顯微紅外快速成像系統（IMV Microreader）來檢查精子濃度。對樣品中形態異常的精子進行計數（數25格），根據異常精子的比例對精子濃度進行了校正。校正過程不考慮附著原生質滴的精子比例。根據校正過的精子濃度，決定該次射精的精液可分成多少份授精劑數，以及總稀釋容積應為多少。然後對公豬號、采精人員、采精總容積、每毫升精子數（百萬）、尾部捲曲精子的比例（％）、附著原生質滴的精子比例（％）、死亡精子比例（％）等情況進行記錄。
精液置於恒溫裝置中，維持在37℃。采精2分鐘後，將精液取出恒溫裝置，等分為兩份。一份加入100ml稀釋液，標為E；另一份不加任何稀釋液，標為O（表 1）。之後將兩份精液重新放回恒溫裝置。采精6分鐘後，按計算好的稀釋容積將兩份精液完全稀釋。分別從兩份精液中各取一滴滴於載玻片上，置顯微鏡下檢查精子活力。精子活力大於70％的為合格，小於70％的為不合格。如果E、O當中任何一份不合格，就將兩份精液全部棄置。然後將2到5份完全稀釋的精液按E組和O組混合，再檢查精子活力。然後用Cryovet自動包裝機將混合後的精液包裝好，貼上標籤。經過預稀釋的精液貼上紅色標籤，未經預稀釋的精液貼上藍色標籤。包裝好的精液在室溫下冷卻30至45分鐘，然後轉入16℃的環境中。

表 1: 稀釋劑分組和稀釋時間
E組	1: 2分鐘時用100ml稀釋劑預稀釋	2: 6-8分鐘時加入其餘的稀釋劑
O組	6-8分鐘時加入全部稀釋劑

精液完全冷卻之後，就可以拿到母豬場去授精了。從每份混合精液裏流出一份樣品，分別於24、48、72、96和120小時對樣品進行測評。如果上述任何時間發現某份混合精液的品質不合格，就通知母豬場，將該份精液棄置。

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精液被派發到5家母豬場（共計1,700頭母豬），每家豬場接到的O組和E組精液劑數相同。各家豬場按自己的操作規程進行精液處理、發情檢查，並對母豬進行人工授精。試驗過程中各家豬場僅採用試驗精液，直到試驗精液用完為止。所有精液都在採集後5天之內用完。各豬場用相同劑數的O組和E組精液進行授精，雙號的母豬用E組精液授精，單號母豬用O組精液授精。本試驗中一共用了98份混合精液。
統計分析
研究開始之前，我們做了統計鑒定力分析，要想鑒定出分娩率上5％的區別，每個處理需要大約985頭母豬；要想鑒定出窩產仔數上0.5頭/窩的區別，每個處理需要大約645窩（鑒定力＝0.80，置信概率＝0.05）。試驗抽樣為母豬。引數為處理（也就是精液處理技術）。因變數為受胎率、分娩率和總窩產仔數。採用羅傑斯梯回歸分析來檢驗不同處理對受胎率有無影響。對窩產仔數做了方差分析，對分娩率做了卡方分析。通過在窩產仔數和分娩率的分析當中加入適當的因數，可利用多重回歸和羅傑斯梯回歸來對結果的一致性進行驗證。
結果
用經過預稀釋的精液授精的母豬受胎率（87.7）與用未經過預稀釋的精液授精的母豬受胎率（91.8）之間差異不顯著（置信概率P＝0.12；危險係數比OR＝1.26，95％置信區間CI為0.94至1.70）。試驗總共分析了1,666頭母豬、1,288窩仔豬的數據。兩組處理之間分娩率（76.5％，78.1；P＝0.46）和窩產仔數（11.73，11.63；P＝0.58）均無顯著差異（表 2）。

表 2: 授孕結果
處理	分娩率 (標準誤)	N (分娩率)	總產仔數 (標準差)	N (總產仔數)	繁殖性能指數
預稀釋	76.5% (1.5%)	838	11.73 (3.04)	641	897
未預稀釋	78.1% (1.4%)	828	11.63 (3.38)	647	909

羅傑斯梯回歸分析證明兩種處理之間分娩率沒有顯著差異（P＝0.27；OR＝1.07，95％ CI：0.83至1.05）。對窩產仔數進行多重回歸分析的結果（全回歸決定係數R2＝0.10，P＝<0.0001）也一樣，預稀釋與未預稀釋精液之間差異不顯著（P＝0.86）。然而，兩組之間窩產仔數的方差卻存在顯著差異（P＝0.0054，圖 1）。

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結論與應用
預稀釋和未預稀釋精液授精所得的分娩率和總產仔數均無差異。因此，在完全稀釋之前先進行預稀釋是沒有效果的。省去預稀釋的步驟，可節省精液處理的人工。如果預稀釋每份精液需要多用30秒，那麼對於每天需要對100頭公豬進行采精的豬場來說就是50分鐘左右。每週就是5.83小時，每年303小時。按每小時工資10美元算，每年需要多花費的人工成本就是3,000美元左右。

省去預稀釋步驟，還可以降低操作過程出現錯誤的風險，比如稱量過程的錯誤、精液傾灑，或者同一份精液被預稀釋了兩次，或忘記預稀釋，從而造成稀釋比例不準確。

然而，預稀釋精液與未預稀釋精液授精後得到窩產仔數之間的方差存在著顯著差異，說明這個問題上仍需要進一步研究。
參考資料
1 Johnson, L.A., Weitze,K.F., Fisher,P., and Maxwell,W. M.C. “Storage of boar semen”，Animal Reproduction Science 62:1-3, pp. 143-172. August 2000.

2 Ibid.

3 Althouse, G.C., Kuster, C.E., Clark, S.G., and Weisiger, R.M. “Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended porcine semen”，Theriogenology 53:1167-1176. 2000.

4 Kuster, C.E., Althouse, G.C., and Schaeffer, D.J. “Statistical and biological significance in the use of marketed ‘Long-term’semen extenders”，In: Boar Semen Preservation IV, eds. L.A. Johnson and H.D. Guthrie, Allen Press, Inc., Lawrence, Kan., 129-135,2000.

各位參考看看~~~可能和國內之前的報告有不同的見解    也還是要各位大大自己去体會才有心得~~~不要忘了   要分享喔~~
還有上面的圖我搞不出來     哈  哈   請見諒~~~~

[ 本帖最後由 李仔 於 2008-6-13 12:59 編輯 ]